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本文關鍵詞:激光掃描共聚焦顯微鏡,顯微技術
定位、定量
三維重組
動態測量
*活細胞或組織內游離Ca2+濃度的測量
*活細胞內H+濃度( pH值)的測量
*自由基的檢測電動轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網絡公司激光雕刻機
*藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量
應用:細胞膜電位的測量
熒光漂白恢復(FRAP)的測量
籠鎖解籠鎖的測量
熒光能量共振轉移(FRET)的測量
其他應用
1.標記細胞器熒光探針
(1)細胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細胞
碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞
Hochest 33258 (同上)
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活細胞
460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細胞
SYTO 活細胞
(2)溶酶體 Lysosome中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器官為非特異性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞 LysoTracker Blue LysoTracker
Red
(3)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞 ¨細胞器的單克隆抗體
(4)內質網 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標記內質網,較低濃度標記線粒體
(5)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ,可染活細胞,陽離子性,可檢測線粒體膜電位, 且在多數細胞中停留時間短
JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發綠光
線粒體膜電位低時為多聚體 490/590 發紅光
可標記活細胞線粒體,且為檢測線粒體膜電
位較佳探針: Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞 ,
穩定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 還原型, 只能染活細胞
2、定位、定量
免疫熒光標記(單標、雙標或三 標)的定位、定量.如:細胞膜受體或抗原的分布,
微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位
細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位雜交-fitc + PI
熒光原位雜交: 染色體基因定位
單細胞凝膠電泳
GFP的表達
游離Ca2+ 的分布與定量
定位、定量研究中常用熒光探針
1)Amine-Reactive Probes與抗體耦聯、與配體耦聯、與肽耦聯、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯的探針,可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等
1)FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
2)TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
3)異硫氰基熒光素 494/518
4)PE 藻紅蛋白 565/578
5)Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618
6)cy5 650/690
7)cy3 490/530
(1)細胞膜表面受體
配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)
標記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC
(2)細胞表面抗原、胞內某種蛋白
免役熒光標記: 與抗體耦聯,
直標: 一抗+熒光探針電動轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網絡公司激光雕刻機
間標: 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白 抗 tublin抗體+熒光探針 肌動蛋白 Palloidine+熒光探針
3. GFP 綠色熒光蛋白
GFP的的發現:60年代,Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發光蛋白(aequoren),該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產生藍色熒光.然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色,后經證實在水母體內還存在另外一種發光蛋白即綠色熒光蛋白電動轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網絡公司激光雕刻機
GFP, 后經研究表明,在水母體內Ca2+和腸腔素與水母發光蛋白結合后,水母發光蛋白產生藍色熒光,GFP在藍激光的激發下,產生綠色熒光.將外源基因與GFP DNA
相連, GFP可作為外源基因的報告基因實時監測外源基因的表達.
GFP主要應用: 對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態觀察
如: 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達
GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞, 可動態觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程
GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網、高爾基體、線粒體等細胞器的結構及病理過程:定位與定量測量應注意的問題
定位:1.可以對圖像進行修飾,
2.pinhole 可盡可能的小.
3.確認共定位時要取兩個通道熒光相互干擾的對照圖像
定量:
1.儀器的各個條件必須一致
2.必須用原始圖像進行定量測量
3.Pinhole盡可能的大
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